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多肽是如何做到分离和纯化的？

时间：2020-04-13 14:34 作者：小分子肽 来源：泰博吉信 点击:次

多肽制备时因合成法成本高且产量低，发酵法分离目标活性肽困难，常采用蛋白质酶水解法，然而其产物除多肽外，还含有部分未水解的蛋白质、氨基酸、蛋白酶等，为了得到目标活性多肽，还需要更深层次的分离纯化。目前，可用于多肽分离纯化的方法主要有超滤、盐析、凝胶、离子交换层析、色谱法、电泳法等，这些方法都是基于氨基酸与多肽、多肽与多肽、多肽与蛋白质之间的分离纯化而建立起来的，根据不同的需要实际应用中常常是几种方法的联合使用，现将常用的分离纯化方法列举如下。
 
（1）超滤
超滤是根据超滤膜孔径的大小对处理样品按照分子量大小及形状进行分离。超滤是膜分离法中最常用的分离纯化多肽的方法，在处理多肽样品的过程中要将酶解过程与超滤分离过程两道工艺串联起来，根据处理样品的特性选用合适的膜材料，以实现对产物分子量的控制。超滤法在操作过程中需要消耗大量的水分，因此后期浓缩会消耗时间，并且如果初始料液预处理不当会造成膜孔堵塞，影响膜的使用寿命，成本比较昂贵。
 
（2）盐析：
高浓度的中性盐可以使溶液中的大分子物质聚积形成沉淀，此过程为盐析。蛋白质及肽的特征基团如-NH2、-OH、-COOH都是亲水性基团，可与水形成水化层，随之与蛋白分子共同作用形成亲水性胶体，使蛋白质分子彼此之间作用力降低，从而增加了蛋白质和多肽的溶解性。向蛋白酶解液中加入大量的高浓度的中性盐，中性盐会夺走大量的水分子，破坏了膜结构，疏水基团暴露出来，电荷被中和，亲水性胶体被破坏，进而蛋白质和多肽聚积成沉淀，获得目标多肽。盐析法虽然操作简易、成本低，但是在此过程中不可避免地增加多肽盐的含量，影响多肽的口感等。
 
（3）纳滤：
纳滤是分离性能介于反渗透膜和超滤膜之间的一种分离方式，纳滤膜具有纳米级孔径，截留分子量在100～1000D，而小分子多肽和氨基酸的相对分子量在100～1000D，都是两性电解质，分子中既含有酸性基团又含有碱性基团，当溶液的pH等于其等电点时，分子呈电中性，净电荷为零；当pH偏离等电点时，分子成为带正电荷或负电荷的离子，所以采用纳滤膜通过空间位阻和电荷效应的共同作用可对溶液中的多肽和氨基酸进行分离。采用纳滤技术分离纯化多肽与氨基酸主要是基于道南（Donnan）效应和空间位阻效应，纳滤膜的分离选择性由两种效应共同决定，其中Donnan效应受溶液pH、离子强度和组成及多肽、氨基酸浓度与膜表面电性等因素影响，因此采用纳滤进行多肽分离纯化的过程中要严格控制多种影响因素。目前，采用纳滤分离技术对氨基酸和多肽进行分离纯化的研究已取得很多成果，由于多肽与氨基酸混合溶液的复杂性及膜制品的单一性，还未进入实际应用，大部分处于实验室研究阶段。
 
（4）凝胶过滤色谱法：
凝胶过滤色谱又称分子排阻色谱、分子筛层析等，凝胶过滤色谱法是以多孔凝胶填料为固定相，利用多肽分子的大小、性状差异等达到分离纯化的目的。凝胶过滤色谱的原理是根据组分的分子大小进行分离，当待分离的组分进入层析柱后，大分子组分不能进入凝胶的颗粒内，只能从凝胶颗粒的缝隙中随洗脱液流动，洗脱速度较快；小分子组分可直接进入凝胶颗粒内，在凝胶颗粒与凝胶缝隙之间随洗脱液流动，洗脱速度缓慢。因此，根据层析柱内的移动速度不同，大分子组分先被洗脱下来，小分子后续洗脱下来，达到分离纯化的目的。在进行蛋白质、多肽、氨基酸分离纯化时需根据分子大小确定具有足够分离范围的介质，并选择适当的凝胶颗粒。目前，凝胶过滤色谱法已被广泛应用于蛋白、多肽的分离纯化，其具有操作方便、分离迅速的优点。
 
（5）离子交换层析法：
离子交换层析是利用固定相与被分离组分之间可以进行离子交换将物质进行分离纯化的一种方法，离子交换剂通常是固定相。离子交换层析法根据树脂所带电荷的不同可分为阳离子交换和阴离子交换。在进行离子交换层析时，要注意考察交换介质的选择、缓冲体系的选择、溶液配制等多重影响因素。目前离子交换层析法因其重复性好、操作简单、洗脱范围广等优点，较适合于工业化生产。
 
（6）高效液相色谱分析方法：
高效液相色谱分析方法相对于其他分离方法具有更高的准确性和优越性，高效液相色谱分析方法在分离纯化蛋白质和多肽的过程中最常用到的是反相高效液相色谱，其分离原理是根据待分离的组分在固定液中分配性能的不同实现分离，该方法适用于分离纯化分子量在5000D以下的组分，尤其是分子量低于1000D的小分子肽类物质。高效液相色谱分析方法在分离纯化多肽方面具有分离效果好、检测灵敏度高、分离纯化速度快等优点，较适合于分离纯化高纯度的多肽产品。
 
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