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游离氨基酸含量对多肽有哪些影响？

时间：2020-04-17 15:43 作者：小分子肽 来源：泰博吉信 点击:次

迄今为止，自然界中已发现180多种氨基酸，其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种，称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式，一种是以游离态存在于生理体液（血浆、尿）、食品（酒、饮料）中，另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。目前，工业上多肽生产主要采用酶生化反应对蛋白质进行水解或利用微生物发酵法制取。蛋白质水解液和发酵液中除多肽外，还含有少量的大分子蛋白及分子量较小的游离氨基酸。与游离氨基酸相比，多肽的渗透压低，吸收率高，食后不会引起腹泻等不良反应；多肽又具较低的抗原性，不会引起过敏反应。因此，游离氨基酸的含量也成为多肽品质评价的一项重要指标。多肽生产中可通过对酶解程度进行控制，防止过度酶解使多肽含量降低、游离氨基酸含量增高。
常用的游离氨基酸检测方法主要有以下几种：柱后衍生高效阳离子交换色谱法、柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱积分脉冲安培检测法、毛细管电泳技术等。
 
柱后衍生高效阳离子交换色谱法（HPCEC）是一种经典的氨基酸分析方法。此方法主要是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子并在阳离子交换柱中分离，分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外-可见分光光度检测器检测。采用阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术的商品化的自动氨基酸分析仪在20世纪60年代初问世，现在的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化，分析时间已缩短至1小时以内。目前，专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料，衍生试剂为茚三酮或荧光胺等。柱后衍生高效阳离子交换色谱法可应用于多肽样品中氨基酸的测定，但色谱仪器较复杂，需要通过泵和反应器以保证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合，使仪器局限于一类分析。
 
近20年来，柱前衍生反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分析氨基酸得到了迅速发展，逐渐取代柱后衍生HPCEC在许多领域中的应用。RP-HPLC分析方法更加灵敏、快速，而且与局限于氨基酸分析的自动分析仪不同，HPLC适用性极广。柱前衍生的关键在于衍生试剂的选择，选择衍生试剂的标准包括能与各氨基酸定量反应，同时每种氨基酸只生成一种化合物且产物有一定的稳定性，不产生或产生易于排除的干扰物。目前多肽中的氨基酸分析多采用柱前衍生反相高效液相色谱法进行检测。
 
高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法（HPAEC-IPAD）是一种新的氨基酸分析方法，该方法是基于氨基酸分子中的羧基在强碱性介质中可以形成阴离子，而氨基酸分子中的氨基在强碱性介质中通过施加一定的电位，可在贵金属（金、铂）电极表面发生氧化反应，进而实现氨基酸的阴离子交换色谱分离及积分脉冲安培检测。HPAEC-IPAD分析氨基酸不需要对氨基酸进行衍生化处理，可直接进行分离、检测，对氨基酸的检出限为pmol～fmol级，目前部分多肽生产厂家采用该方法进行氨基酸含量的测定。
 
毛细管电泳技术（CE）主要适合于氨基酸的手性分离，毛细管电泳技术主要利用离子在电场力作用下迁移速度的不同对氨基酸组分进行分离和分析。由于多数氨基酸的紫外可见光谱的吸收极弱，自身又无荧光，所以通常要对氨基酸进行衍生化处理，使之具有较强的紫外或荧光吸收，以便于检测，其重点研究领域是多肽类药物的制备和临床样品的分析。
 
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